Himedia維生素B12測定培養基 Vitamin B12 Assay Medium

Himedia維生素B12測定培養基 Vitamin B12 Assay Medium

貨號:M036-100G

品牌:HIMEDIA

產品系列:干粉培養基

包裝:100克

保存條件:

有效期:

產地:印度

維生素B12測定用培養基

貨號

品名

規格

儲存條件

保質期

M036

Vitamin B12 Assay Medium

100G

8°C下密閉保存,理想是放置于干燥器中。

使用新鮮配置的培養基。干粉見標簽有效期。

原理

乳酸桿菌生長需要特別的營養,因而在非選擇性培養基上很難生長。維生素測定用培養基用于維生素的微生物法測定。該方法需要三種培養基:即維持培養基,用于保持菌種活力;接種培養基,用于測試菌液的制備;測定用培養基,用于待測維生素的定量。

維生素B12測定用培養基,不含維生素B12,但包含所有其他維生素和必要養分,用于萊士曼乳酸桿菌(ATCC 7830)的生長。萊士曼乳酸桿菌(ATCC 7830)作為測定用菌,最早由Capp等人描述(1)并被美國藥典和美國分析化學家協會(AOAC)所推薦(2,3)。

用已知稀釋度的維生素B12標準品,可以制備標準曲線(2,3)。

測試菌液的制備是將將活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養基中,推薦在37°C 孵育24 小時,再離心、清洗、重懸于10 ml 生理鹽水中,再通過濁度分析或酸度分析,確定生長反應。

??用維生素B12的濃度及對應的吸光度制作標準曲線。用標準曲線可確定待測樣本中的維生素B12的濃度。

應非常小心地避免培養基和玻璃器具的污染。應使用潔凈的無去污劑的玻璃器具。少量的外源物質的污染可能導致錯誤的結果。

用于接種的測定菌應在專用的培養基中培養。

應用

維生素B12測定用培養基推薦采用萊士曼氏乳酸桿菌(ATCC 7830)作為測定用菌,進行維生素B12的微生物法測定。

培養基組分

成分?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??克/升

無維生素酸水解酪蛋白 ? ? ? ? ? ? ? ? 15.000

葡萄糖 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 40.000

天門冬酰胺 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.200

醋酸鈉 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 20.000

抗壞血酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4.000

L-胱氨酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.400

DL-色氨酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?0.400

硫酸腺嘌呤 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020

尿嘧啶 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020

黃嘌呤 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020

核黃素(維生素B2) ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.001

鹽酸硫胺素 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.001

生物素 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.00001

煙酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.002

對氨基苯甲酸(PABA) ? ? ? ? ? ? ? ?0.002

泛酸鈣 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.001

鹽酸吡哆醇 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.004

鹽酸吡哆醛 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.004

鹽酸吡哆胺 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.0008

葉酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.0002

磷酸二氫鉀 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1.000

磷酸氫二鉀 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1.000

硫酸鎂 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.400

氯化鈉 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020

硫酸亞鐵 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020

硫酸錳 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020

聚山梨酯80 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2.000

鹽酸鳥嘌呤 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020

最終pH值 (25°C) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6.1±0.2

質量控制

?外觀——奶油色至黃色,具均勻性,傾向形成可容易分解成粉末狀的軟塊

?制備好的培養基顏色和透明度——淡琥珀色透明溶液,可能有輕微沉淀

?配比濃度——在25°C下8.5%w/v(8.5g/100ml水)水溶液,pH值為6.1±0.2

?pH值——5.90-6.30

配置

稱取8.45g干粉培養基溶于100ml蒸餾水,必要時加熱使培養基完全溶解?;靹?,使輕微的沉淀均勻分布。測定時,分裝試管,每管為5ml培養基(包含標準品和待測樣品)。加蒸餾水,使總體積達到10ml。高壓消毒15磅121°C 5分鐘。立即冷卻培養基。每個試管(10 ml)的維生素B12水平為0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.2 ng時,均可獲得滿意結果。

培養反應

進行微生物法測定維生素B12。采用萊士曼氏乳酸桿菌(ATCC 7830),35-37°C孵育18-24小時。

生長狀況

隨著測定管標準品水平升高,(美國藥典維生素B12標準水平,0,0.025,0.050,0.075,0.1,0.125,0.150,0.2ng),目標菌生長逐漸遞增,伴隨著620nm處吸光度的增加。

文獻

1. ?Capps B. E., Hobbs M. H. H. and Fox S. H., 1949, J. Biol. Chem., 178:517.

2. The United States Pharmacopoeia, 2006, USP29/NF24, The United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD.

3.??H. Williams, (Ed.), 2005, Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 19th Ed., AOAC,Washington, D.C

微生物法測定維生素的方法學評估

在我國,微生物法測定食品中的維生素B12、葉酸、泛酸、煙酸、生物素是首選方法,因此在國民生計中起到重要作用。本文擬以維生素B12為例,從方法學的角度就微生物法的特點,作一文獻上的綜述。

1954年,微生物法測定乳品中的維生素B12首次出現,是由英國國立奶業研究所、維生素B12的研究專家Margaret E. Gregory首先建立,她用該法測定來自不同動物種屬的奶中的維生素B12的含量(1)。

微生物法測定乳品和食品中的維生素B12,在上世紀90年代引入我國。關于這一方法,已有多篇報道進行了方法學上的探討?,F總結如下:

(一)對微生物法的評估

上海市食品藥品檢驗所蔣孟虹等人用微生物法測定了腸內營養粉劑中的維生素B12 含量。她們認為,高效液相色譜法僅適用于常量分析,維生素B12對色譜前處理要求高, 因此色譜很難滿足痕量測定的要求。但微生物法操作步驟較多, 一些因素可能影響測定結果的準確性。因此,她們對影響因素進行了研究,結果發現:

?測試菌液的透光率在60%~80%之間時, 標準曲線的線性擬合較好,過高過低均導致線性擬合差。

?當測試菌液的加入量為50μL時, 標準曲線線性擬合良好。過多易導致濁度過高而不成梯度。

?標準曲線最高濃度點的透光率在30%左右為佳測定時間, 此時各濃度點的透光率差別較大, 可拉開梯度。

?維生素B12 在0.001~0.010 ng/mL 濃度范圍內線性關系良好。

她們認為,微生物法檢出限低、靈敏度高,測定結果準確可靠, 適用于微量維生素B12的含量測定, 值得經常進行維生素檢測的實驗室應用推廣(2)。

國家乳制品質量監督檢驗中心的張玉杰等人提出:微生物法的好處是,測定的是維生素的生物活性含量,更具生物學意義。同時,微生物作為一種活試劑,具有自身的特異性和高度的靈敏性,使得測定結果更為準確。微生物分析法測定VB12在國際上已有幾十年的歷史,只是在我國報導還不是很多。

他們采用微生物法對12個奶基嬰幼兒食品的VB12含量進行了多次重復測定,發現相對誤差均在10%以內,50%的樣品測定的誤差小于5%,回收率多在90-110%之間。因而該方法是可行的,結果也是準確可靠的(3)。

廣東產品質量監督檢驗研究院林耀文等人發現,微生物法測定含乳飲料中的維生素B12,重復性良好,線性相關系數大于0.99,平均回收率為91.20%~102.2%,檢出限為0.04ng/ml,具有簡便、快速、靈敏度高、檢出限低等優點。(5)

(二)微生物法的干擾因素和注意事項

國家乳制品質量監督檢驗中心的張玉杰等人提出了幾點注意事項:

第一,有些細菌可以產生Vb12,因此所有玻璃器皿及用具都要嚴格清洗,嚴格滅菌。清洗后放入250℃烘箱,加熱1-2小時。整個分析過程都要注意防止溶液過多地暴露于光線中。

第二,建議每個梯度標準溶液設三個平行檢驗管,減少誤差。所有檢驗管滅菌后要迅速水冷卻,盡量避免顏色形成。冷卻速度要一樣。

第三,測定菌體濃度時,要等檢驗管內發育和繁殖過程完全停止后再進行。(3)

湖北省宜昌市產品質量監督檢驗所陳緒華等人觀察了測定培養基的不同品牌對維生素B12線性的影響。發現青島海博和北京陸橋的維生素B12測定培養基作出的線性結果不理想,主要是培養基所含的本底較高。而更換為BD的測定培養基后,所得的線性結果較理想。本底存在,會導致目標物質的促生長作用減弱(即吸光度沒有等量增加)。當測定培養基中不含本底時,菌懸液以及培養時間的微弱變化只影響標準曲線的生長量,不影響曲線的線性。(4)

據我們了解,目前BD的維生素B12測定培養基已停產,因此可選用國際知名的微生物生產商HiMedia的產品。

上海市質量監督檢驗技術研究院王志偉等人強調,菌種的活力和純度對實驗結果有非常大的影響,應嚴格按照要求進行菌種純化(7)。

(三)對標準微生物法的改進

廣州市質量監督檢測研究院吳環等人提出了幾個更簡便的操作技巧用于維生素B12的測定:一是試驗體系的體積縮小。用1.2mlPP小管替代了傳統的試管進行標準曲線溶液及樣品溶液的培養和測定;標準曲線溶液和樣品溶液的制備也在1.2mlPP小管中進行,由此避免了大量玻璃器皿的使用,同時顯著降低了外部干擾;二是將試驗菌株預先固定在96排管,利用甘油保護冷凍的菌種。具體操作為:將萊士曼氏乳酸桿菌凍干菌株活化后,接種到乳酸桿菌肉湯培養基,(36.0±1.0)℃培養18~24h,將增菌肉湯培養物3000r/min離心數次,棄去上清液,使用含有甘油的維生素B12測定培養基進行適宜的稀釋后,將菌懸液加入1.2mlPP小管中,-80℃凍存備用。該方法極大地縮短了試驗周期,而且菌株活力穩定,保證了試驗的有效性。(6)

吳環等人進一步將該方法推廣到嬰幼兒配方乳粉中的其他3種水溶性維生素(葉酸、生物素、肌醇)的測定,結果同樣有效。(8)

上海市質量監督檢驗技術研究院王志偉等人對于天然燕麥的維生素B12的測定,加入了1%的 α-淀粉酶溶液,發現酶解溶液有助于提取維生素B12,降低樣品粘度,更方便測量,因此優于現有的標準方法。

以上探討雖然大部分是針對維生素B12,但對于采用微生物法測定的其他水溶性維生素如葉酸等也同樣有效,可以借鑒。

參考文獻:

1)?Margaret E. Gregory. The Microbiological Assay of ‘Vitamin B12’in the Milk of Different Animal Species.British Journal of Nutrition, 1954,8(04): 340

2)蔣孟虹、許蘋等. 微生物法測定腸內營養粉劑中微量維生素B12?的含量.食品安全質量檢測學報. 2016,7(3):893-897

3)張玉杰、呂為群.奶基嬰幼兒食品中維生素B12活性測定微生物分析法.生物技術,1993(6):39-43

4)陳緒華、劉健、江一飛. 不同測定培養基對維生素B12線性的影響. 生物技術世界. 2013(4):47

5)林耀文、佘之蘊,李姣等.微生物法測定含乳飲料中維生素B12含量. 飲料工業.2013,16(4):39-42

6)吳環、劉冬虹、張慧、聶炎炎、黃宇峰.微生物法快速檢測食品中維生素B12含量的應用研究.中國乳業.2014,(4):42-44

7)王志偉、徐瓊、陳欣欽、曲勤鳳. 天然燕麥中維生素B12的測定中2種微生物法前處理方式的比較.食品安全質量檢測學報, 2017,8(1):275-279

8)劉冬虹,吳環,聶炎炎,黃宇鋒. 優化微生物法快速測定嬰幼兒配方乳粉中4種水溶性維生素.華南預防醫學,2014(6):594-597

維生素測定原理及注意事項

維生素是維持機體不可缺少的一類營養,雖然需要量小,但十分重要,一旦缺乏,會引發相應的維生素缺乏疾病。嬰幼兒食品和乳品中含有天然的維生素,有的也有人工添加。在食品外包裝上,會要求印有該食品含有哪些營養素及其含量多少(1)。我國的國家食品安全標準中,對嬰幼兒食品和乳品中的維生素含量也有規定,如每 100 千卡的食品中的葉酸含量最少為 10.5 μg,最多不超過 50.2 μg(2)。之所以限定維生素的最高量,是因為維生素攝入過多,也會引發一些問題。

那么,如何來測定這些維生素的含量呢?根據國家出臺的標準,不少維生素含量是采用色譜的方法來測定。有五種維生素是采用微生物法。它們是葉酸、維生素 b12、煙酸、泛酸和生物素。本文重點講述前兩種。以葉酸為例,微生物法的原理是,根據細菌對葉酸的營養需求,在一系列不含葉酸的培養基中從低到高添加已知含量的葉酸以及待測的食品樣品,在 37°C 孵育 18 小時。因為有了葉酸,細菌能生長得很好,培養液發生渾濁。細菌越多,培養基就越渾濁,吸光度就越高。通過已知含量的葉酸樣品的吸光度,以及待測樣品的吸光度,就能確定待測樣品中的葉酸含量。

測定所用的菌株均有規定。葉酸為鼠李糖乳桿菌,又稱作干酪乳桿菌鼠李糖亞種(ATCC 7469)(3),維生素 b12 為萊士曼氏乳酸桿菌(ATCC 7830)(4),均可從 ATCC 等菌種庫購買。維生素測定所用的培養基可以自己配,也可以購買商品化的培養基,其來源好是經過國際認證的微生物培養基生產廠家,如 HiMedia Laboratories 公司,這樣質量較為可靠,其培養基組成也符合食品中葉酸和維生素 B12 測定的食品安全國家標準。

在測定中有兩個非常重要的注意事項:一是由于滅菌條件,孵育溫度等因素會影響標準曲線讀數,并且每次該不會完全一樣,因此每次測定時都應同時制備標準曲線。二、應小心避免培養基和玻璃器具遭受污染。雜菌生長會導致實驗失敗。同時應使用潔凈的無去污劑的玻璃器具。因為任何少量的外源物質都可能導致測定結果的偏離。

測定前還需要進行菌株的培養和接種菌液的制備。接種菌液來自于儲備菌種。但保存數周以上的儲備菌種,不能立即用作接種液制備,實驗前宜連續傳種 2-3 代以保證細菌活力。所用培養基也都有商品化的可選。

總之,微生物法測定微生物 B12 和葉酸等維生素靈敏度高,但也需要注意避免測定中可能產生的一些問題,這樣才能最終把實驗做好。

注釋:
(1)GB 13432—2013《食品安全國家標準 預包裝特殊膳食用食品標簽》
(2)GB10765—2010《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》
(3)GB 5009 211-2014《食品安全國家標準 食品中葉酸的測定》
(4)GB 5413 14-2010《食品安全國家標準_嬰幼兒食品和乳品中維生素 B12 的測定》